基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在口腔潜
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在口腔潜
宋业青，陈峰，张翼飞
北京大医院中心实验室
口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室，口腔数字医学北京市重点实验室
基金项目：PKUSS
发表于年《临床实验室》杂志第五期
摘要：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrixassistedlaserdesorption/ionizationtime-of-fightmassspectrometry，MALDI-TOF
MS）是近年来发展起来的一项新型软电离质谱技术，它的诞生和发展奠定了用蛋白质指纹图谱鉴定微生物的基础。目前这项技术不但可应用于肿瘤、风湿性关节炎、阿尔茨海默病等的诊断，更重要的是还可用于微生物鉴定，改变了以往需要通过形态学、生理生化反应现象等常规鉴定方式，为微生物的鉴定带来了革命性的变化。
关键词：基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱，微生物鉴定，蛋白指纹图谱
微生物可以引发许多传染病，包括食物中毒，败血症，亚急性感染性心内膜炎，脑膜炎和化脓性感染，这其中的大部分疾病如果不能尽早肯定致病因子并给予相应的后续医治药物都有可能威逼生命。除这些较严重的疾病之外，常见的慢性胃肠病、蛀牙等生理疾病中的行动改变也都与微生物有关；肝性脑病、多发性硬化等中枢神经系统生理疾病也可能由微生态改变引发；抑郁症、孤独症等精神疾病与肠道细菌状态和比例有关[1]。故此微生物的快速分离和鉴定就变得十分重要。但是，分离菌株的常规鉴定基本是基于表型测试，包括革兰氏染色、培养和生长特性、生化图案，这些方法主要依赖致病菌的生长代谢，检测周期较长，并且带有一定的主观性，不能满足临床上对致病菌进行快速诊断的需要。而细菌16SrDNA扩增及测序技术被视为细菌鉴定的金标准[2]，更适用于鉴定常规方法难以检测的微生物。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，由多个恒定区和与之相间的可变区组成[3]。各种细菌的恒定区无显著差异，而可变区在不同细菌之间有所不同，具有种属特异性[4]，可以此来鉴定细菌。这种方法虽然准确，但耗时长、费用高，对实验室及操作人员的要求也较高[5]，因此，微生物鉴定的进程需要一种更快速、准确和经济有效的辨认方法来代替现
有常规鉴别技术。
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）仪器主要由基质辅助激光解吸离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）两部份组成。其基本原理是用一定强度的激光照耀基质与样品构成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，将能量传递给样品，使样品解吸附，样品和基质之间产生电荷转移从而使样品产生电离，电离的样品在电场的作用下加速飞过飞行管道，并被检测器检测到。不同离子的飞行时间与其质量电荷比值成正比。完全的细菌可以产生特定的蛋白指纹图谱，通过和数据库中的图谱进行比对可以对未知微生物进行鉴定[6]。
与传统的生化表型鉴定方法和分子生物学方法相比，MALDI-TOFMS是简便快速、高通量、低成本，并且准确性较高的鉴定技术，在对病原微生物进行快速鉴定方面具有良好的运用前景，有可能取代现有的对真菌和细菌鉴定方法。现有的菌株数据库已相当完备，除部份少见菌株因数据库还没有建立相干参考谱图而暂时没法鉴定外，MALDI-TOFMS已能够鉴定出大部分的细菌[7]；VanVeen等[8]对株临床分离细菌和酵母菌进行了前瞻性实验研究，结果表明，MALDI-TOFMS对菌株进行准确鉴定的准确性要高于传统的生化方法（92.2%和83.1%）[6]。在酵母样真菌鉴定方面，MALDI-TOFMS鉴定效果也很好，大大快于常规鉴定方法，并且通过特殊的标本处理流程，也可用于丝状真菌鉴定。另外，MALDITOFMS已能够成功地用于部份微生物亚种水平的鉴定和耐药机制的检测[7]。
有临床相干研究表明：针对败血症患者取样分离的菌株，鉴定的准确率已到达91.7%[9]，在快速鉴定10株取不同临床样本（如血液、脓疮、伤口擦拭等）分离的不同绿色链球菌的实验中，在种水平上达到了基因型%吻合[10]。在另外一项研究中，已报导在种水平上辨认尿液样品的病原菌准确率已到达91.8%[11]。除鉴定微生物的种类以外，MALDI-TOFMS还可以检测细微菌株特异性的差异。它已成功地用于辨别甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌和野生型金黄色葡萄球菌[12]、氨苄青霉素抗性大肠杆菌[13]、和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌同基因型替考拉宁敏感和替考拉宁抗性株[14]。微生物引发的疾病中，龋病是人类的常见疾病和多发病。年至年进行的全国第三次口腔流行病学调查表明，5～6岁儿童和65～75岁老人的患龋率分别高达66.0%和75.2%[15]。龋病虽然进展缓慢，但若不及时医治，病变向牙体深部发展，可引发牙髓病、根尖周病等，严重者乃至影响全身健康[16]。
从病因学角度而言，龋病是牙体硬组织的细菌感染性疾病。研究表明，变异链球菌、乳酸杆菌均是重要的龋病相干致病菌，具有很强的产酸、耐酸能力，造成口腔局部的微酸环境，通过构成菌斑生物膜粘附在牙面，延长酸在牙齿表面的滞留时间，终究牙体硬组织脱矿速率大于再矿化速率，构成龋洞［17］。因此，如能快速准确检测变异链球菌和乳酸杆菌，肯定龋病高危人群，将对龋病预防和诊断有很重大的意义。
MALDI-TOFMS目前已被应用于蛀牙相干微生物的检测研究中[16,18]，该研究收集份18至75岁的成年人非刺激性唾液，使用基于MALDI-TOFMS系统的Clin-TOF质谱仪（北京毅新博创生物科技有限公司），对这份唾液样本进行细菌分离纯化处理后收集了质谱谱图，并对蛀牙相干的乳酸杆菌（Lactobacillus）及变异链球菌（Streptococcusmutans）进行了鉴定。收集谱图的同时，采取细菌鉴定经常使用的16sPCR的方法对分纯后的细菌进行了鉴定。两组数据相比较证实：北京毅新博创生物科技有限公司的Clin-TOF方法鉴定结果在属的水平上与常规的基于16SrDNA基因测序结果的一致的乳酸杆菌到达88.6%，变异链球菌的灵敏度为96.0%，与16SrDNA测序结果的一致率为98.7%。
综上我们可以得到结论：MALDI-TOFMS是一种高通量、快速且操作简便的方法，鉴定微生物的灵敏度和一致率都很高，并且随着技术的发展，MALDI-TOFMS的运用和准确度还会有进一步的提升，相信能够为临床检测提供更快更便捷和本钱更低廉的新选择。
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