Epi4K癫痫遗传学合作研究项目简介及成
在上一篇文章中，我们介绍并解读了了Epi4K于年刊发在Nature杂志的“Denovomutationsinepilepticencephalopathies”这篇文章。在该篇文章中，Epi4K报道了具有统计学意义的两个癫痫脑病新致病基因GABRB3、ALG13及一批癫痫脑病候选致病基因。实际上，在所报道的癫痫脑病候选致病基因中，有数个基因从其所编码蛋白质的功能性质角度而言，是极为可能的癫痫脑病新致病基因。但是，正如美国医学遗传学和基因组学学会和美国分子病理学协会（theAmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomicsandtheAssociationforMolecularPathology，ACMG-AMP）所制定了新一代测序变异解析指南中所言，遗传学验证是最佳、最重要的候选致病基因验证。正所谓“功能都会唱歌，遗传实乃王道”，Epi4K在在癫痫脑病遗传学研究的后续验证工作中，进一步扩大样本量，在癫痫脑病的遗传学研究项目中，又取得了新的成果
一、DeNovoMutationsinSynapticTransmissionGenesIncludingDNM1CauseEpilepticEncephalopathies
该篇文章于刊发于TheAmericanJournalofHumanGenetics杂志（AmJHumGenet.Oct2;95(4):-70），在研究中，Epi4K将EPGP、EuroEPINOMICS-RES两组织新提供的92名IS/LGS患者及其正常父母进行了外显子组测序，并与年癫痫脑病遗传学研究项目的个IS/LGS患者及其正常父母的外显子组测序数据进行了合并分析，得到了如下结果：
1、以denovo突变的PolyPhen-2评分做X轴、RVIS值做Y轴的话，可将该denovo突变绘制成点分布图，理论上代表denovo突变的点越接近右下角话，denovo突变所带来的“危害性”越大。如果将PolyPhen-2评分≥0.95、RVIS限定于百分之25的话，可以得到局限于分布图右下角的“hotzone”，理论上位于“hotzone”内的denovo突变都属于“罪大恶极、十恶不赦”的突变。
如图A所示，在个正常对照的denovo突变中，仅有50个正常对照的denovo突变（12.17%）位于“hotzone”，而在个IS/LGS的denovo突变中，却有74个IS/LGS患者的denovo突变（31.90%）位于“hotzone”，两者差异具有统计学意义（P=3X10-9）。该结果是年Epi4K刊发于Nature文章的结果的进一步扩展，通过该结果可以进一步推算出在RVIS百分之25以内的基因中，可能有个基因的突变会导致癫痫脑病，适当修正了年刊发于Nature文章的结果（90个基因）。
2、Epi4K在年刊发于Nature文章的基础上，新发现了3个IS/LGS患者携带DNM1基因的denovo突变，P值达2.99X10-10，完全肯定了DNM1是IS/LGS新的致病基因。5名患者均表现为2-13月龄之间发病的IS，其中4名患者转型为LGS，所有患者均存在严重的智力障碍、肌张力低下、语言功能丧失，其中部分患者在出现癫痫发作表现之前已出现智力障碍表现，这说明在DNM1突变所导致的癫痫脑病的致病机制中，神经系统发育障碍可能独立于癫痫发作而存在。
3、名患者的denovo突变位于的基因，可构成一个由个基因所组成的互作网络，其中42个基因（30.2%）与突触传递相关。
4、提出三个高度可疑的IS/LGS候选致病基因，分别为GABBR2、FASN、RYR3，该三个基因均有两个IS/LGS患者携带位于其的denovo突变，但尚未达到统计学意义。
二、DeNovoMutationsinSLC1A2andCACNA1AAreImportantCausesofEpilepticEncephalopathies
该篇文章于刊发于TheAmericanJournalofHumanGenetics杂志（AmJHumGenet.Aug4;99(2):-98.），在研究中，Epi4K采用
分子倒置探针（Molecularinversionprobes,MIPs）技术，对名各型癫痫脑病（EEs）患者进行了27个基因的突变筛查。具体解析如下：
1、什么是MIPs？这里借用我一位非常优秀的好朋友、目前在苏大附二神经内科工作的李凯博士的毕业论文中的描述，对该技术进行简单介绍。
“在液相杂交法的探针捕获中，分子倒置探针（MIPs）是一种操作简单、成本很低的方法。年，Prof.JayShendure团队首次建立MIPs技术，对基因组序列中感兴趣区域的序列进行捕获、富集，并对捕获后的文库进行高通量测序及测序数据分析，分析结果肯定了MIPs技术在靶向捕获中的特异性及准确性。MIPs技术的成功研发为靶向捕获提供了新的选择，这种新型多重靶向捕获测序方法，将构建测序文库与高通量测序有机结合的同时，大大降低了靶向捕获测序的成本。该方法操作简便，结合成本很低的特点，为大样本基因组序列变异筛查、疾病罕见变异研究提供了新选择，并广泛应用到疾病遗传因素研究中。”
2、患者组成
不能分类的癫痫脑病，名
IS，90名
LGS，41名
肌阵挛-失张力发作癫痫，80名
早发癫痫脑病，33名
癫痫性失语，20名
SCN1A阴性的Dravet综合征，15名
热/感染相关癫痫，14名
慢波睡眠中持续棘波放电的癫痫脑病（CSWSS），13名
婴儿游走癫痫，8名
良性儿童部分性癫痫变异型，7名
早发肌阵挛癫痫脑病，4名
大田原综合征，1名
合计，名患者，以癫痫脑病为主
3、筛查基因的选择
在年Nature所刊发文章中，有2个以上IS/LGS患者携带denovo突变的基因：ALG13、GABRB3、DNM1、HDAC4
该研究进行时，新确定的EE致病基因：GNAO1
已知癫痫/EE致病基因或同家族内关系较近的基因：CACNA1A,GABRB1,GRIN1,MTOR,PIK3AP1,SLC1A2,IQSEC2,SLC35A2
与已知癫痫致病基因存在蛋白质互作：HNRNPH1,NEDD4L
位于癫痫致病性CNV内：YWHAG
RVIS25%且基因功能有致病可能性：DNAJC6,EMILIN3,TRIM32,RALGAPB,VSP37A,EPHB1,NFASC,PLXNA1,SMURF1,THOC2,TRIM32,ZFHX3
4、总体结果
在对该名患者所进行的27个基因的突变筛查中，发现了17名患者携带其中7个基因的致病/可能致病突变（ALG13,CACNA1A,DNM1,GABRB3,GNAO1,IQSEC2,SLC1A2），解释了该患者组百分之3.2的致病原因，其中
ALG13,CACNA1A,DNM1,GABRB3,GNAO1,SLC1A2这六个基因有两个以上患者携带其突变，其中有7名患者携带了GABRB3的突变，4名患者携带了CACNA1A的突变。
5、SLC1A2
在年Epi4K发表于Nature的文章中，就已经报道了一位IS患者携带了SLC1A2的denovo突变。在本次研究中，Epi4K又发现了两名患者携带SLC1A2的denovo突变，彻底坐实了SLC1A2是癫痫脑病新的致病基因这一发现（P=0.）。SLC1A2编码兴奋性氨基酸转运体2蛋白，是谷氨酸的主要转运体之一，主要表达于星形胶质细胞，可清除位于突触外间隙的谷氨酸。三名突变携带者均为表型极端严重的癫痫脑病患者，均为出生后一周内发病且有严重的智力障碍以至于没有智力倒退显现（学霸可以说考试从分倒退到了90分，5分学渣就没有倒退空间了，同理）。
6、GABRB3
本次研究中，新发现GABRB3突变7例。有意思的是，加上年所发现的4例GABRB3突变IS/LGS患者，GABRB3突变所导致的临床表型可谓是“多种多样，丰富多彩”。在新发现的7例GABRB3突变携带者中，包括1名LGS患者、1名肌阵挛-失张力发作癫痫患者、4名不能分类的癫痫脑病患者以及一名疑似Dravet综合征患者，而该名疑似Dravet综合征患者又来自于一个GEFS+家系且突变在家系内与表型共分离。除了绝大部分携带者都为出生后1年内发病之外，是否存在智力障碍、智力障碍程度、发作形式均不一而同，存在相当大的临床异质性。
7、CACNA1A
本次研究中，发现了4个患者携带CACNA1Adenovo突变，但有意思的是，其中一名患者有一个共患病同胞，也携带该“denovo”突变，经验证证实该两名患者的母亲为CACNA1A突变嵌合状态，外周血淋巴细胞所提取DNA中6.3%携带CACNA1A突变。在年Epi4K发表于Nature的文章中，就已经报道两名IS/LGS患者携带CACNA1Adenovo突变，加上本次研究中所新发现的5名患者所携带的突变，也彻底坐实了CACNA1A是癫痫脑病新的致病基因这一发现（P=8.0X10-5）。在7名CACNA1A突变携带患者中，有6名患者在出生后一天即发病，甚至前文所述的共患病同胞在胎儿时期即出现了疑似宫内癫痫发作，而其中3名患者出生后两小时即出现癫痫发作，故发作起病极早可能是CACNA1A突变所导致癫痫脑病的一个特征。
8、其他
一名患者携带DNM1denovo突变，而该名患者也有一个共患病同胞，也细带该位于DNM1基因的“denovo突变”，经验证证实该两名患者的父亲为DNM1突变嵌合状态，外周血淋巴细胞所提取DNA中5.5%携带DNM1突变。
三、总结
1、鉴于癫痫脑病的遗传异质性，大样本量是保证研究成功的必须条件之一。在年Epi4K癫痫脑病遗传学研究的基础上，通过扩大样本量验证，证实了DNM1、CACNA1A、SLC1A2为癫痫脑病的致病基因。
当然，如果你是下图那样的天命之子、无敌幸运星，也可以试试小样本量。
2、在Epi4K的癫痫脑病遗传学研究中，共发现11个GABRB3致病突变，占患者总数的百分之1，这是相当惊人的比例。
3、在年的研究中，Epi4K在14个具有两个患者以上的癫痫脑病家系中，发现其中两个家系存在体细胞嵌合现象。而之前在关于Dravet综合征患者的父母的体细胞研究嵌合研究中，将近百分之10的Dravet综合征患者的父亲/母亲存在体细胞嵌合。结合这两个研究结果，父亲/母亲作为体细胞嵌合的正常人，将突变以生殖细胞突变形式传递给孩子从而发病，这种“伪装”成denovo突变致病的遗传模式可能在癫痫脑病中并不罕见，然而尴尬的是这种情况往往要在家庭中出现第二个患儿才会被医生所怀疑和重视。故是否应该在头胎为癫痫脑病患者、检测出“denovo致病突变”的情况下，二胎对相应突变进行相关产前检测筛查，是非常值得思考的事情。
4、保守估计，癫痫脑病的致病基因应当至少还有一半以上未被发现。癫痫脑病的遗传研究大有可为！
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